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Quando a mãe de Isaac começa a ouvir a voz de Deus exigindo que seja feito um sacrifício para provar sua fé, Isaac foge para o porão enfrentando hordas de inimigos enlouquecidos, irmãos e irmãs perdidos, seus medos e, eventualmente, sua mãe.
The Binding of Isaac é um jogo de tiro RPG de ação gerado aleatoriamente com elementos pesados do tipo Rogue. Seguindo Isaac em sua jornada, os jogadores encontrarão tesouros bizarros que mudam a forma de Isaac, dando-lhe habilidades sobre-humanas e permitindo-lhe lutar contra hordas de criaturas misteriosas, descobrir segredos e lutar para chegar à segurança.